中国AV CHINESE 国产

<var id="r1t5j"></var>
<var id="r1t5j"></var>
<var id="r1t5j"><strike id="r1t5j"></strike></var>
<cite id="r1t5j"></cite> <cite id="r1t5j"><video id="r1t5j"><thead id="r1t5j"></thead></video></cite><var id="r1t5j"><video id="r1t5j"></video></var>
<var id="r1t5j"></var>
<cite id="r1t5j"><video id="r1t5j"></video></cite><cite id="r1t5j"><span id="r1t5j"><thead id="r1t5j"></thead></span></cite>
<cite id="r1t5j"><video id="r1t5j"></video></cite>
<var id="r1t5j"><strike id="r1t5j"><listing id="r1t5j"></listing></strike></var>
<var id="r1t5j"></var>
立 可 為
下載專區 首頁 > 下載專區 > 論文文章

淺談PCR儀溫度校準的必要性及方法

分享到:
更新時間:2016年04月11日16:53:02 打印此頁 關閉
摘要: 淺談PCR儀溫度校準的必要性及方法 朱晨彬 ,朱毅晨,姚麗芳,張麗萍,陳宇,朱學平 (上海市計量測試技術研究院)   摘要:本文分析了PCR儀使用的現狀及其進行溫度校準的必要性。提出了PCR儀溫度校準的方法和校準項目(溫度準確性,溫場均勻性,升降溫速率,最大超調溫度)以及數據處理方法,并分析了每...
文件大小 更新時間 下載地址
556KB 2016-04-11 16:53:02 本地下載

淺談PCR儀溫度校準的必要性及方法

朱晨彬 ,朱毅晨,姚麗芳,張麗萍,陳宇,朱學平

(上海市計量測試技術研究院)

 

摘要:本文分析了PCR儀使用的現狀及其進行溫度校準的必要性。提出了PCR儀溫度校準的方法和校準項目(溫度準確性,溫場均勻性,升降溫速率,最大超調溫度)以及數據處理方法,并分析了每一校準項目的重要性。

關鍵詞:PCR儀,溫度校準,溫度準確性,溫場均勻性,升降溫速率,最大超調溫度

 

一、 引言

    PCR是聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction)的簡稱,是在短時間內體外大量擴增特定的DNA片段的分子生物學技術。自動完成聚合酶鏈反應,提供DNA 擴增的溫度條件而設計的儀器稱為PCR儀。

    PCR儀主要用于DNA片段的放大,可將DNA分子或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,在這過程中主要是3個特征溫度循環:

1. 高溫變性:把樣品加熱至90~95℃讓DNA模板變性變成單鏈。

2. 低溫退火:讓樣品的溫度迅速下降至50~65℃,引物就可以結合到模板上去。

3. 適溫延伸:讓樣品的溫度上升至70~75℃,DNA聚合酶就可以從引物開始用底物復制出新鏈。

因此,在PCR反應過程中對溫度控制的要求很高,良好的溫度控制是PCR儀質量好壞的關鍵。

二、PCR基因擴增儀校準的現狀

PCR儀的控溫精度、升降溫速率以及溫場的均勻性等直接影響DNA片段擴增的結果。PCR儀經使用后,其溫度傳感器的計量特性會發生變化,作為計量設備一般須經定期校準后方能繼續使用。

幾乎進行聚合酶鏈反應試驗的實驗室(如基因判別、親子鑒定、DNA個體識別)都會使用多臺擴增儀以滿足實驗需求。而且,實驗室內的基因擴增儀都是常開常用,使用頻率高,很難保證其性能指標符合實驗要求。各實驗室對PCR儀的質量控制還停留在自檢自校和依賴于廠商的售后支持。

我院于2006年編寫了基因擴增儀(PCR儀)的校準規范JCJ/E111025.1/0-2006,早已開展PCR儀的溫度校準項目。使用標準裝置:

          裝置名稱

性能

PCR儀)校準儀

特點

加熱槽溫度動態實時檢測

適用工況

任何工況

測溫通道數

16

溫度測量范圍

0-110)℃

系統分辨率

0.01

測溫準確度

±0.10

采樣頻率

2Hz

 

由于需要PCR儀升降溫速率較快, 故要求溫度傳感器的熱慣性小(滯后要小),反應靈敏。因此,校準過程使用熱敏電阻作為測溫傳感器。標準測試程序為:

序號

溫度點

持續時間

步驟1

30°C

1:00 分鐘

步驟2

95°C

3:00 分鐘

步驟3

30°C

2:00 分鐘

步驟4

90°C

3:00 分鐘

步驟5

50°C

3:00 分鐘

步驟6

70°C

3:00 分鐘

步驟7

60°C

3:00 分鐘

步驟8

30°C

1:00 分鐘

通過專用軟件進行數據處理及分析,并繪制溫度循環測試曲線。見圖一

                    圖一   pcr溫度循環測試曲線

三、 PCR儀溫度校準的項目及必要性

一個穩定的溫度循環是成功實現PCR所必需的。其中溫度控制的動、穩態特性是影響PCR擴增結果正確與否的最重要因素之一, 這包括溫度準確性、升降溫速度、溫場均勻性、最大超調溫度。

(一)、溫度準確性

溫度準確性是PCR儀最重要的性能指標,如溫度準確性低可直接造成非特異性擴增,甚至是錯誤的擴增結果,造成假陽性和假陰性。

市場上各家廠商考核基因擴增儀(PCR儀)性能的主要指標,一般廠家的企業指標為±0.5℃,一些性能較好的產品可以實現的溫度準確度為±0.3℃。故需對PCR儀控溫準確度進行測試。

    校準實驗平均溫度的計算公式為:

I—參加檢測的溫度探頭序號;n—參加檢測的溫度探頭的數量

(二)、溫場均勻性

    由于PCR儀加熱器加熱不均勻,導致PCR儀模塊上各孔存在一定溫差。造成試驗結果偏差。一般PCR儀邊緣點的溫度低于中間區域,所以均勻性為PCR儀重要的性能指標。一般廠家的企業指標規定均勻性為±0.5℃,一些性能較好的產品可以實現的溫度均勻度為±0.3℃。

    校準實驗時,通過選取孔板中16個特殊反應位置(如圖2所示)來測量溫度,并得出孔板的溫度均勻性。均勻性為各個探頭在同一時刻最大溫度與最小溫度的差值。均勻度計算公式為:tmax-tmin  (tmax =最大溫度;tmin =最小溫度)

                 圖二  96孔板探頭布點示意圖

(三)、升降溫速率

PCR擴增產物數量的多少決定了PCR的效率。為了在短時間內獲得盡可能多的產物,需要儀器在升降溫段具有按照預設升降溫速率快速升溫和降溫的能力(最大升溫速率達15~20℃)。一個完整的PCR過程,是由若干個升溫→恒溫→降溫循環構成的。因為“變性”,“退火”和“延伸”3個階段是必須要保證的。因此,只有使升降溫的過程盡可能地迅速,才能縮短每個PCR循環以及整個PCR 過程所需時間。一般廠家的企業指標規定升溫速率為±3/sec。

儀器校準實驗時,升溫速率為溫度從40℃到90℃的時間;降溫速率為溫度從70℃到35℃的時間。詳見圖三

             圖三      PCR降溫速率計算示意圖

(四)、最大超調溫度

    當溫度從一定點溫度調節到另一定點溫度,就會產生溫度的超調。超調溫度過大同樣會對試驗產生影響,所以校準實驗時,需要計算最大超調溫度和平均超調溫度。見圖四

          

                圖四      溫度曲線超調溫度部分

四、 結束語

聚合酶鏈反應(PCR)技術由于其極高的檢測靈敏度和特異性已經越來越多地應用于臨床檢驗、司法鑒定等工作中。有多種原因會造成PCR擴增的錯誤結果,排除實驗過程中人為因素造成的誤差,PCR儀溫度控制系統工作性能的優劣是造成檢驗結果出現偏差甚至錯誤的至關重要因素。通過對PCR儀的定期校準可以極大的避免PCR過程中假陽性或假陰性結果的產生,提高PCR試驗的準確性和穩定性。

 

參考文獻

[1] 王宇松,佟慧艷,張文超.影響PCR儀溫度控制精度的因素分析[J]. 生命科學儀器, 2007, (02) .

[2] 陳居德,楊明. PCR擴增基因檢測中的溫度控制[J]. 儀器儀表用戶, 2004, (01) .

[3] 張文超,劉曉光,吳勤勤. 基因擴增分析(PCR)儀溫控系統的研究與應用[J]. 華東理工大學學報, 2004, (02) .

[4] 陳居德,楊明. PCR擴增基因檢測中的溫度控制[J]. 儀器儀表用戶, 2004, (01) .

[5] 薛生虎,李東升,葉子弘,俞曉平,方榮瑞. 基于多傳感器融合技術的PCR儀溫度校準系統[J]. 儀器儀表學報,2011,(06)

Introduction to the necessity and method of temperature calibration for PCR instrument

Zhu Chenbin,Zhu Yichen,Yao Lifang,ZhangLiping,Chen Yu,Zhu Xueping

Abstrat:The situation of using PCR intrument and the nessity of its temperature calibration is introducted. The mathod of PCR instrument’s temperature calibration is given by this article.  The temperature calibration items for PCR instruments that contain the temperature accuracy, temperature uniformity ,velocity of temperature change,max overshoot temperature and mathods of data analysis are also introducted. So is the temperature analysis of each calibration items

Key words: PCR instrument;temperature calibration;temperature accuracy;temperature uniformity;velocity of temperature change;max overshoot temperature 

中国AV CHINESE 国产